Penentuan Struktur Lysozyme dengan Difraksi Sinar –X resolusi 1,4 Å

Artikel ini dilihat sebanyak 116 kali

Struktur 3D dari 1LMN

Struktur 3D dari 1LMN

Semester 5 ini saya mengambil mata kuliah pengantar metode difraksi. Di mata kuliah tersebut saya belajar menentukan struktur 3D protein dengan difraksi sinar-X. Karena saya mengambilnya waktu PRS (perubahan rencana studi) maka saya baru ikut kuliah pada tanggal 18 september 2008.  Selama satu semester ini kami mendapat satu tugas besar yaitu menentukan struktur lysozyme (HEWL). Lysozyme adalah enzim yang mengkatalisis polisakarida (karbohidrat) yang banyak terdapat pada dinding sel bakteri. Kami diberi empat file, satu file mtz yang berisi data hasil pengukuran difraksi sinar-X dari lysozyme, satu file pdb dari kode protein 1LMN sebagai model, dan dua file pdf yang berisi data urutan residu protein HEWL dan 1LMN. Kami juga mendapat beberapa lecture tentang difraksi, kristralografi, teori difraksi dan panduan dasar mengunakan software CCP4 dan wincoot untuk menentukan struktur 3D protein.

struktur 3D model Lysozyme awal

struktur 3D model Lysozyme awal

Tahap pertama yang dilakukan adalah menentukan kandungan air dalam kristal protein dengan menggunakan cell content analysis pada tanggal 2 November 2008. Dari tahap ini diperoleh kadar air dalam lyzosyme sebesar 38,3% dan koefisien Methew adalah 1,9 untuk monomer (untuk mengetahui apakah lyzosyme mengkristal sebagai monomer, dimmer, dll). Tahap selanjutnya juga pada 2 november yang dilakukan adalah molecular replacement. Tahap ini adalah membuat model untuk protein lysozyme dengan menggunakan struktur protein 1LMN sebagai model awal serta dilakukan rotasi dan translasi untuk menentukan posisi yang sesuai dengan resolusi 20 hingga 3,0 Å . Model yang saya buat dari molecular replacement diperbaiki dengan rigid body refinement karena protein yang mirip biasanya masih memiliki beberapa lekukan dan orientasi yang berbeda. Dari perbaikan tersebut diperoleh Rfactor model HEWL yang saya buat sebesar 0.44359 (kesalahan 44,359 %) dan Rfree 0.45228. Suatu model protein diterima jika Rfactor (kesesuaian atom di model dengan kerapatan electron) kurang dari 0.2 dan perbedaan Rfree (apakah atom berada di kerapatan electron yang tepat atau tidak )   Rfactor  tidak lebih dari ± 0,05 . Tahap selanjutnya adalah density modification untuk mengurangi fasa bias dari air dan model. Selanjutnya dibuat electron density map dengan map dan mask utility. Model dan electron density map dibuka dengan wincoot dan dimutasi untuk menyesuaiakan residu asam amino model dengan hasil sequencing lysozyme dan diatur sedimikian rupa sehingga model saya sesuai dengan electron density map yang ada.

electron_density_map_awal

electron_density_map_awal

Tanggal 3 november, model saya yang telah dimutasi dan diatur dengan wincoot kemudian diperbaiki dengan restrained refinement dengan resolusi 30 Å – 2,5 Å. Dari hasil perbaikan ini diperoleh model baru dengan  Rfactor 0,2811 dan Rfree 0,4233. Tahap selanjutnya adalah membuat electron density map yang baru yang lebih baik yang kemudian electron density map dan model dibuka dengan wincoot. Pada wincoot, model saya atur sedemikian rupa hingga model saya sesuai dengan electron density map yang ada.  Model saya yang telah diatur tersebut diperbaiki lagi dengan restrained refinement dengan full resolusi 54,646 Å – 1,4 Å dan air juga dimasukkan ke dalam model dan diperoleh model baru dengan Rfactor 0.24990 dan Rfree 0.28030. Sebagaimana tahap sebelumnya, kemudian  dibuat electron density map baru. Sebagai catatan, biasanya  menurunkan Rfactor dan Rfree menjadi ~ 0.3 tidak terlalu sulit, tetapi menurunkan hingga 0.2 biasanya cukup sulit. Model kemudian diperbaiki dengan wincoot agar sesuai dengan electron density map dan Ramacandhran. Ramacandhran menunjukkan apakah sudut putaran di C-α residu asam amino benar apa tidak karena asam amino memilki gugus samping bahkan diantaranya yang cukup besar seperti tyrosin dan histidin sehingga agar tolakan antar gugus samping asam amino minimal maka sudut putaran tiap asam amino dalam konformasi struktur sekunder harus tertentu, kecuali glysin karena gugus sampingnya adalah hydrogen yang  kecil.  Selain itu, Ramacandhran menunjukkan keplanaran ikatan peptide pada protein. Proses perbaikan dengan Restrained refinement dan wincoot disebut iterasi.

Electron_density_map_Lysozyme_akhir

Electron_density_map_Lysozyme_akhir

Iterasi terus saya lakukan hingga pada 5 november Rfactor model saya 0.19335 dan Rfree 0.22721. Saya sangat senang karena saya bisa menyelesaikan struktur protein hanya dalam empat hari padahal tugas itu satu semester. Sampai sekarang, 22 November saya masih sesekali memperbaiki model saya hingga Rfactor saya sekarang 0.18214 dan Rfree 0.20811. Perlu diketahui,  menurunkan sebesar 0,01 pada range lebih kecil dari 0,2-an adalah pekerjaan yang sangat sulit. Demikianlah liku-liku penentuan struktur protein dengan menggunakan metode difraksi sinar-X. Ini hasil model yang saya buat

Struktur 3D Lysozyme Akhir

Struktur 3D Lysozyme Akhir

Dari gambar di bawah juga dapat terlihat sisi aktif lysozyme (cekungan di sebelah kiri atas). Di artikel berikutnya, insya Allah saya akan membahas tentang interpretasi struktur lysozyme dalam menjelaskan mekanisme katalisis reaksi hidrolisis karbohidrat.

Daftar Pustaka :

Fresht, A. (2000) Structure and Mechanism In Protein Science. New York : W. H. Freeman and Company

Related Post